Ученые Томского политехнического университета (ТПУ) вместе с коллегами из Чехии предложили новый подход к оценке активности ферментов. Созданный плазмонно-активный оптоволоконный сенсор позволяет проводить процедуру быстро и с минимальным нарушением ферментативной системы. Разработка открывает перспективы для определения критически важного параметра многих технологических процессов — активности ферментов — непосредственно в биохимических реакторах, а также в суспензии тканей или микроорганизмов.
Ферменты, являясь естественными биологическими катализаторами, могут значительно ускорять химические реакции. Помимо их чрезвычайно важной биологической функции в живых организмах, ферменты активно используются в различных технологических процессах. Например, они нашли широкое применение в биохимических реакторах в качестве катализаторов для широкого спектра процессов, включающих изготовление пищевых продуктов и добавок, модификацию антибиотиков, создание датчиков и аналитических приборов, а также для производства различных чистящих средств.
Большинство «коммерческих» ферментов извлекают из бактерий или растений. При этом активность ферментов, особенно выделенных из микроорганизмов, может существенно различаться в зависимости от источника, особенностей развития микроорганизмов и окружающих условий. Кроме того, активность ферментов может снижаться в процессе их использования из-за постепенной деградации. Поэтому этот параметр необходимо тщательно контролировать при их производстве и использовании.
По словам ученых, актуальной остается разработка методов экспрессного и наименее инвазивного определения ферментативной активности. Традиционные методы измерения ферментативной активности требуют отбора образца и его очистки для проведения дальнейшего анализа. Таким образом, практически невозможно оценить активность фермента in situ.
Авторы предлагают для локальной, простой экспресс-оценки активности фермента использовать биохимический сенсор, созданный на основе плазмон-активного оптоволоконного зонда. Образцы зонда изготовили из многомодовых оптических волокон на основе кварцевого стекла, на поверхность которых методом плазменного напыления нанесли покрытие из тонких полосок золота. Исследователи поясняют, что золото среди других плазмонно-активных металлов было выбрано потому, что оно наиболее химически стабильно и имеет пик плазмонного резонанса в удобной спектральной области. В качестве модельной реакции химики рассматривали оценку активности β-глюкозидазы. Этот фермент встречается в клетках почти всех живых организмов и выполняет множество разнообразных функций, например, участвует в деградации биомассы, антибактериальной защите организма, клеточном биосинтезе и так далее.
«Ключевым моментом в исследовании является придание сенсору чувствительности только к одному определенному ферменту, в нашем случае, β-глюкозидазе. Этого возможно добиться путем селективной модификации поверхности зонда β-глюкозидами — специфичными субстратами для этого фермента. Функционализация поверхности при помощи нового ключевого реагента — соли диарилиодония, содержащей β-фенил глюкозид и электроноакцепторный лиганд, привела к селективному введению β-глюкозидов, что и придало сенсору такую высокую чувствительность и селективность по отношению к ферменту», — рассказала заведующая лабораторией «Химическая инженерии и молекулярный дизайн», один из авторов статьи Елена Степанова.
Активность фермента определяли в разных температурных условиях – от 20 до 80 °C — и с использованием различных растворов. Проведенные эксперименты показали, что предлагаемый научным коллективом подход позволяет просто и быстро определить активность β-глюкозидазы.
«Мы продемонстрировали преимущества данного подхода на простой биохимической системе (фермент β-глюкозидаза и гликозидный субстрат), но аналогичная концепция может быть расширена на ряд альтернативных ферментов и соответствующих субстратов путем прививки различных субстратов к плазмон-активным оптоволокнам и их ферментативного расщепления, регистрируемого по сдвигу полосы поглощения плазмона в отраженном свете», — отметала Елена Степанова.
По мнению ученых, разработанный сенсор в перспективе может применяться для in situ мониторинга активности ферментов в биохимических реакторах или в живых тканях. Кроме того, он может быть использован для оценки активности бактерий в условиях окружающей среды, например, при мониторинге почвы или воды.
Источник: https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/nauka/98783/